Temas de FC |
M.G. Palacios-Verdú, L.A. Pérez-Jurado
Unidad de Genética, DCEXS, Universitat Pompeu Fabra,
Instituto Hospital del Mar de Investigaciones Médicas (IMIM), y Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), Barcelona
Resumen
Las dos últimas décadas han sido testigo de un desarrollo importante de nuevas tecnologías moleculares y métodos analíticos que permiten estudiar casi toda la información genética de un individuo a un precio cada vez más reducido. Junto con otras tecnologías más tradicionales enfocadas en el análisis específico de una o pocas regiones del genoma, proporcionan una amplia gama de posibilidades para el estudio de las bases moleculares de las enfermedades. Las micromatrices de DNA o microarrays y la secuenciación de última generación están ya siendo ampliamente utilizadas como herramientas diagnósticas en el ámbito prenatal y postnatal. El objetivo de esta revisión es describir brevemente la batería de recursos tecnológicos disponibles, tanto algunos tradicionales como los de nueva generación, y definir sus indicaciones y aplicabilidad en la medicina clínica actual |
Abstract
The last two decades have seen very relevant developments of novel molecular technologies and analytical tools that have the capacity to study the almost entire genetic information of an individual at a progressively decreasing cost. Along with more traditional technologies focused on the specific analysis of one or a few regions of the genome, they provide a wide range of possibilities for the study of the molecular basis of disease. DNA microarrays and next generation sequencing are already being widely used as diagnostic tools in the prenatal and postnatal setting. The objective of this review is to briefly describe the battery of technological resources available, both traditional and new generation, and define their indications and applications in current clinical medicine |
Palabras clave: Genética; Exoma; Genoma; Microarray.
Key words: Genetics; Exome; Genome; Microarray.
Pediatr Integral 2014; XVIII(8): 515-528
Nuevas metodologías en el estudio de enfermedades genéticas y sus indicaciones
El entendimiento de las bases moleculares de la patología humana y la posibilidad de su estudio con aplicaciones diagnósticas y/o pronósticas avanza de manera rápida en los últimos años de la mano de los avances tecnológicos. En genética humana, el desarrollo de nuevas metodologías, como los microarrays y la secuenciación de última generación, junto con los diversos proyectos internacionales para el estudio del genoma humano y su diversidad, así como de otros organismos modelo, están permitiendo el desarrollo de nuevas aplicaciones y abordajes para realizar estudios clínicos. Estas técnicas han sido ampliamente utilizadas en el campo de la investigación, y mediante una rápida transición ya están siendo utilizadas como herramientas de diagnóstico molecular. En poco tiempo, hemos pasado de disponer solo de herramientas para el estudio molecular dirigido de algunas enfermedades, necesariamente basado en una sospecha clínica muy fundamentada, a tener la posibilidad de realizar el análisis completo más exploratorio del genoma de un paciente o de la parte codificante del mismo, el exoma. El objetivo de esta revisión es describir brevemente las técnicas moleculares que están siendo utilizadas habitualmente en la práctica clínica, incluyendo las nuevas tecnologías disponibles, y definir sus indicaciones ya establecidas, hoy en día, con relación a los distintos tipos de enfermedades genéticas.
Enfermedades genéticas
Las enfermedades genéticas pueden estar causadas por mutaciones genéticas, mutaciones genómicas, alteraciones cromosómicas o cambios epigenéticos, y pueden encontrarse en todas las células de un individuo o solo en un porcentaje de ellas (mosaicismo).
Las enfermedades genéticas pueden estar causadas por alteraciones que afectan a la secuencia del ADN codificante o regulador de los diversos genes (mutaciones genéticas), a la estructura o número de copias de fragmentos de un cromosoma (mutaciones genómicas), a regiones más grandes de los cromosomas o cromosomas enteros (alteraciones cromosómicas), o a modificaciones químicas sobre la secuencia del ADN (epimutaciones)(1).
Con relación a las enfermedades monogénicas (causadas por alteraciones en un único gen), existen 7.700 defectos genéticos listados en OMIM (Online Mendelian inheritance of Man), que presentan un patrón de herencia compatible con una transmisión según las leyes de Mendel o mitocondrial. De más de la mitad (unas 4.000 enfermedades), se conoce ya la base molecular y la descripción del fenotipo. Hay unas 1.700 con descripción fenotípica y patrón de herencia, pero de las que se desconoce la base molecular, y 2.000 enfermedades restantes de las que se sospecha un origen mendeliano todavía no definido(1). Estas enfermedades monogénicas pueden tener una herencia autosómica recesiva (necesario que las dos copias de un gen estén alteradas para que se produzca la enfermedad), autosómica dominante (el fenotipo aparece con solo una de las dos copias del gen alterada) o, ligada al cromosoma X, tanto dominante como recesiva o intermedia (el gen causante está localizado en este cromosoma). El 15% de las enfermedades que causan disfunción mitocondrial se deben a mutaciones en el propio genoma mitocondrial y tienen un patrón de herencia exclusivamente matrilíneo (Tabla I).
Se denominan trastornos genómicos a los causados por reordenamientos en el genoma humano e incluyen: microdeleciones y microduplicaciones. La mayoría de estos trastornos están causados por la alteración en la dosis o función de genes independientes que están situados de manera contigua en el genoma(1). Algunos ejemplos son los síndromes de: Williams-Beuren (deleción en la banda cromosómica 7q11.23), diGeorge-velocardiofacial (deleción en la banda cromosómica 22q11.2) o de Potocki-Lupski (duplicación en la banda cromosómica 17p11.2) (Tabla I).
Las anomalías cromosómicas pueden ser numéricas o estructurales. Las alteraciones numéricas constituyen cambios en la dotación total o individual de los cromosomas, e incluyen las poliploidías (cuando el número cromosómico es un múltiple del estado haploide y es mayor al número diploide) y las aneuploidías (cuando la ganancia o pérdida del cromosoma no incluye el juego completo de cromosomas). Las aneuploidías de cromosomas autosómicos enteros viables durante el desarrollo fetal son: la trisomía 21, causante del síndrome de Down, la trisomía 13, responsable del síndrome de Patau, y la trisomía 18, asociada al síndrome de Edwards (Tabla I). Otras aneuploidías frecuentes y viables afectan a los cromosomas sexuales, como: la monosomía del cromosoma X (45,X0), causante del síndrome de Turner, la disomía del X en varón (47,XXY), causante del síndrome de Klinefelter, la trisomía X (47,XXX) y la disomía del Y (47,XYY).
Las alteraciones cromosómicas estructurales pueden ser equilibradas, cuando se conserva el contenido de material genético, o desequilibradas, cuando existe una pérdida o ganancia de material genético. Las alteraciones estructurales incluyen las deleciones, duplicaciones, translocaciones (intercambio de material genético entre dos cromosomas), inserciones e inversiones (rotura de material genético en dos puntos, con una reinserción invertida del fragmento), así como otros reordenamientos, como los isocromosomas y cromosomas marcadores(1).
Existen enfermedades genéticas que no son debidas a cambios en la secuencia del DNA, sino a modificaciones químicas sobre la misma secuencia que condicionan cambios en la expresión de los genes. Este campo es la epigenética y abarca alteraciones en la metilación del DNA y modificaciones químicas de las histonas, que son proteínas que empaquetan y regulan el DNA. Dentro de la epigenética, existe el mecanismo de impronta genómica que es relevante para ciertas enfermedades genéticas. La impronta genómica es un proceso epigenético de regulación de expresión génica durante el desarrollo, que determina que solo se exprese una de las dos copias del gen dependiendo del origen parental y que afecta a un número concreto y reducido de genes del genoma humano. Enfermedades asociadas a la alteración de este mecanismo son: el síndrome de Prader-Willi y Angelman o el síndrome de Beckwith-Wiedemann(1) (Tabla I).
Otro concepto relevante en enfermedades genéticas es la disomía uniparental (UPD), que se refiere a la presencia de dos cromosomas homólogos provenientes del mismo progenitor(1). El mecanismo de producción más frecuente es la no-disyunción de la meiosis, seguido por un mecanismo de rescate, ya sea por la duplicación del cromosoma ausente o la pérdida cromosómica subyacente(1). Los posibles efectos de las UPD son: la aparición de enfermedades recesivas, mujeres homocigotas para enfermedades ligadas al cromosoma X, transmisión varón a varón en enfermedades ligadas al X y alteraciones del desarrollo si en el cromosoma involucrado existen regiones con impronta.
Todas las alteraciones que hemos mencionado anteriormente, genéticas, genómicas, cromosómicas o epigenéticas, pueden encontrarse solo en un porcentaje de células de un individuo y no en todo el organismo. Esto se conoce con el nombre de mosaicismo y se define como: la presencia en un individuo o tejido de más de dos líneas celulares con diferente genotipo que derivan en un único cigoto(1). Para presentarse en mosaicismo, la alteración debe haber ocurrido después de la formación del cigoto, durante el crecimiento de células somáticas. Estudios en diversos tejidos de personas fallecidas y en sangre y otros tejidos de personas adultas han demostrado que el mosaicismo para todo tipo de variantes genéticas es muy frecuente, incluso para grandes alteraciones cromosómicas(2). Desde el punto de vista clínico, el concepto de mosaicismo es relevante, porque influirá en la severidad de las manifestaciones clínicas de la enfermedad o en la posibilidad de que aparezca una enfermedad somática por descontrol de la proliferación celular como el cáncer. Existe además, un número creciente de enfermedades causadas por mosaicismo, debidas a la aparición de mutaciones en genes concretos durante el desarrollo somático (Tabla I).
Técnicas de diagnóstico genético. Citogenética y genética molecular
Estas técnicas “tradicionales” pueden estudiar todo el material genético en los cromosomas o dirigirse al estudio de loci específicos. La elección de la técnica molecular se basará en la sospecha diagnóstica, el conocimiento de la causa genética más frecuente, la resolución de la técnica y sus ventajas y limitaciones.
Las técnicas que han sido ampliamente utilizadas a considerar en esta revisión son: el cariotipo, la hibridación in-situ fluorescente (FISH) sobre cromosomas, el MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification) y la secuenciación de Sanger.
El cariotipo es una técnica citogenética muy fiable para la detección de anomalías cromosómicas numéricas y estructurales. El cariotipo tiene una resolución para detectar ganancias, pérdidas o cambios de posición de entre 5-10 Mb de material genético(3) (Tabla II) y no permite detectar alteraciones de número de copia o estructura de menor tamaño. Al analizar numerosas células de manera individual, el cariotipo nos permite detectar mosaicismo para las alteraciones cromosómicas visibles. También, permite detectar inversiones y translocaciones balanceadas (sin pérdida ni ganancia de material genético), siempre que se encuentren dentro del límite de resolución. Es una técnica ampliamente utilizada en el ámbito prenatal, en estudios de infertilidad y en Oncología. Un posible inconveniente para algunas aplicaciones relativamente urgentes, como en los estudios prenatales, es el tiempo de respuesta relativamente largo; ya que, las muestras fetales obtenidas deben ser cultivadas para poder visualizar los cromosomas, requiriendo 2 o 3 semanas de cultivo.
La técnica de FISH fue desarrollada a finales de los años 80 y se basa en el marcaje con fluorescencia de una sonda de DNA complementaria a la región de interés, que es hibridada a extensiones cromosómicas en interfase o metafase(4). Existen diversos tipos de sondas que se pueden utilizar, como: las sondas de pintado cromosómico, las sondas que identifican regiones relevantes de cromosomas (centroméricas o teloméricas) y las sondas específicas de locus. El tamaño de la sonda puede variar desde Kb a 1 Mb(4). Mediante FISH, es posible detectar duplicaciones o deleciones genómicas, así como inversiones y translocaciones balanceadas. El FISH tiene mayor resolución que el cariotipo por su capacidad de detectar alteraciones cromosómicas de menor tamaño, inversiones o translocaciones balanceadas, y también mosaicismo para cualquiera de las alteraciones. Como desventajas, los datos del FISH dependen totalmente de las sondas utilizadas y la tecnología requiere un trabajo técnico importante y poco automatizable. En general, los ensayos diagnósticos por FISH requieren que exista una sospecha clínica para poder seleccionar sondas de locus específico de la región a estudiar. Por ejemplo, para el diagnóstico del síndrome de Williams Beuren, causado por una deleción heterocigota en el cromosoma 7q11.23, se puede utilizar una sonda del gen de la elastina (ELN), que se encuentra dentro de la región comúnmente delecionada. No obstante, existen algunos estudios de cribado a realizar mediante FISH. Mediante sondas subteloméricas, se puede estudiar está región en todos los cromosomas. Dado que, entre el 2 y 10% de los pacientes con discapacidad intelectual sin causa conocida presentan reordenamientos submicroscópicos en regiones subteloméricas(4), el FISH subtelomérico múltiple se convirtió en un estudio de cribado disponible antes de la existencia de microarrays, para el estudio de la discapacidad intelectual o retraso en el desarrollo.
El MLPA permite detectar variantes de número de copias (CNV) hasta en 40 o 50 loci de manera simultánea(5). La técnica se basa en el uso de sondas específicas para cada locus con una región de tamaño variable para poder distinguir cada producto, junto con una región universal que permitirá la amplificación simultánea por PCR marcada con fluorescencia de todas las regiones y su separación por electroforesis capilar para el análisis(5). Tras la normalización con controles, se determina si existe o no alteración del número de copias en cada una de las regiones estudiadas. La ventaja del MLPA radica en la posibilidad de estudiar varias regiones a la vez por un método rápido que no requiere gran infraestructura, lo que resulta en un tiempo de respuesta bajo (aproximadamente entre 1-3 días) y con bajo coste. Sin embargo, mediante el MLPA no se podrán detectar generalmente alteraciones en mosaicismo, ni trastornos genómicos balanceados (como muchas translocaciones o inversiones). Existen ya numerosas sondas y reactivos de MLPA disponibles de manera comercial, si bien es posible hacer el diseño para el estudio de cualquier región genómica. Mediante esta técnica se pueden estudiar de manera fácil, trastornos genómicos recurrentes causados en casi todos los casos por alteraciones genómicas similares y recurrentes (síndrome de Sotos, DiGeorge, Smith-Magenis, entre otros), así como cualquier enfermedad que pudiera estar causada por deleciones y/o duplicaciones de uno o varios genes (en general entre el 2 y el 10% de las mutaciones de muchos genes). También, existe un panel para el estudio simultáneo de todas las regiones subteloméricas.
Mediante una modificación de la técnica de MLPA, “la MS-MLPA” (methylation-specific MLPA), se pueden estudiar también cambios en el estado de metilación del DNA. El procedimiento es similar, salvo que con cada reacción se generan dos productos: uno estándar, para detección de cambios en el número de copias, y otro tras el uso adicional de una enzima de restricción sensible a metilación, que permite cuantificar el grado de metilación del DNA en ese punto concreto. Después de la digestión con la enzima, solo se obtiene un producto de amplificación proporcional al porcentaje del DNA analizado que estuviera metilado. Las ventajas de esta técnica son que permite detectar en un mismo ensayo alteraciones en el número de copias y en el estado de metilación, analizando de manera simultánea varias regiones, y que permite cuantificar y en parte discriminar entre la metilación de ninguno, uno o los dos alelos(6). El MS-MLPA es una prueba de gran utilidad para el estudio de enfermedades causadas por errores de impronta, como los síndromes de Prader-Willi, Angelman, Beckwith-Wiedemann o Russell-Silver.
Para el estudio de mutaciones puntuales en genes conocidos, la técnica de elección es la secuenciación por el método de Sanger, normalmente tras amplificar previamente el fragmento o fragmentos de interés por PCR(7). La secuenciación se basa en la incorporación de dinucleótidos marcados con fluorescencia que luego son detectados mediante electroforesis capilar. La ventaja de esta técnica es su alta validez analítica y clínica. Los inconvenientes son: que es locus específica, puede no detectar variantes estructurales, deleciones o duplicaciones, y tiene un coste-eficacia relativamente bajo cuando se requiere el estudio de un gen de gran tamaño o de varios genes(7).
Nuevas metodologías
Las nuevas metodologías nos permiten estudiar globalmente el genoma, incluyendo cambios en el número de copias y algunos cambios estructurales, así como los cambios en la secuencia nucleotídica o incluso sus modificaciones químicas. Igual que con otras herramientas diagnósticas, es importante conocer las ventajas y limitaciones de estas técnicas, e informar y asesorar correctamente al paciente y familia con respecto a los posibles resultados y opciones.
Las nuevas metodologías para estudios del genoma están transformando de manera rápida la práctica clínica, con la aparición de nuevas guías clínicas para diagnóstico y seguimiento de múltiples enfermedades genéticas (y no genéticas).
Las plataformas de hibridación genómica comparativa en microarrays (aCGH), inicialmente desarrolladas para detectar alteraciones genómicas en cáncer, revolucionaron el mundo de la citogenética. Esta técnica se basa en la cohibridación del DNA a testar y el DNA control marcados con diferentes fluorocromos a un soporte sólido que contiene fragmentos de DNA inmovilizados (sondas). La competición de la hibridación permite detectar ganancias o pérdidas de material en la muestra del paciente respecto al control. La resolución depende del tamaño de los fragmentos de DNA inmovilizados, así como de su densidad y la distancia que existe entre ellos. Cuanto más pequeño sea el fragmento de DNA utilizado como sonda y más cerca se encuentren cada dos sondas consecutivas, mayor la resolución. Inicialmente, se utilizaban como sondas fragmentos de DNA humanos de un tamaño de 100-200 Kb, crecidos en cromosomas artificiales de bacterias (BACs). En la actualidad, se utilizan fundamentalmente sondas de oligonucleótidos que tienen un tamaño entre 25-75 pb(3) (Fig. 1). Mediante aCGH podremos detectar ganancias o pérdidas de material genético en todas las regiones del genoma cubiertas por las sondas, en general casi todo el genoma, excluyendo las regiones repetitivas cuyo análisis no es interpretable. Las ventajas de esta técnica son su mayor sensibilidad y poder de resolución respecto a técnicas previas (para detectar deleciones, duplicaciones o reordenamientos desbalanceados), la posibilidad de automatización y un menor tiempo de entrega de resultados ya que no se requiere cultivo celular para la obtención del DNA(8). Como limitaciones, el aCGH no detecta alteraciones cromosómicas balanceadas (inversiones o translocaciones), reordenamientos en regiones no cubiertas por las sondas, disomías uniparentales ni variaciones en regiones repetitivas, como las expansiones de tripletes(8). También, puede ser difícil detectar alteraciones afectando a todos los cromosomas (poliploidías) y mosaicismos de bajo grado (cuando la alteración está en un porcentaje bajo de las células desde las que se obtuvo el DNA, <20-30%)(9).
Figura 1. Cariotipo molecular por microarray de oligonucleótidos e hibridación genómica comparada (CGH). A. Idiograma del cromosoma 1 y patrón de hibridación de sondas, mostrando una ganancia de material genético en el probando en la banda cromosómica 1q21.1 cerca del centrómero de unas 5 Mb (puntos rojos desviados de la media, hacia +1), compatible con el diagnóstico de trisomía parcial por duplicación 1q21.1, pudiendo corresponder a un cromosoma marcador extra (precisaría cariotipo para confirmar). B. Idiograma del cromosoma 4 y patrón de hibridación de sondas mostrando una pérdida de material genético en la banda cromosómica 4p16.3 distal de unas 14 Mb (puntos verdes desviados de la media hacia –1), compatible con el diagnóstico de síndrome de Wolf-Hirschhorn).
Un tipo de microarray de gran resolución basado en oligonucleótidos es el que incluye polimorfismos de un nucleótido (SNPs). Aporta información sobre genotipos de SNPs en todo el genoma y permite también hacer estudios de asociación con rasgos y enfermedades complejas(3). Para poder obtener el genotipo concreto en cada SNP, solo se marca la muestra del caso, se hibrida al microarray y se cuantifica la señal en cada punto. Esta técnica permite detectar, al igual que el aCGH, ganancias y pérdidas de material genético en todo el genoma. Además, los SNPs nos permiten detectar pérdidas de heterocigosidad, disomías uniparentales y regiones idénticas por descendencia(3) (Fig. 2). Los arrays de SNPs son también más sensibles para detectar reordenamientos presentes en mosaicismo. Dependiendo del microchip, se pueden analizar hasta varios millones de SNPs en un solo ensayo.
Figura 2. Cariotipo molecular por microarray de SNPs. Los microarrays de SNPs nos aportan información de dosis total de hibridación (puntos negros, cuantificados como una relación logarítmica LRR, con valores normales alrededor de 0) y de la dosis relativa de un alelo con respecto al otro denominada BAF (puntos rojos, con tres posibles valores: 1 o 0 cuando los dos cromosomas tienen el mismo nucleótido, y 0,5 en condiciones normales cuando el individuo es heterocigoto). A. Esquema representativo de una translocación recíproca entre los cromosomas 6p y 16p, con segregación desbalanceada en un porcentaje de células somáticas (en mosaicismo), que ocasiona la pérdida de material genético de 6p y ganancia de 16p que se observa en los microarrays mostrados en B y C. B. Patrón del microarray de SNPs del cromosoma 6 mostrando la deleción de unas 25 Mb en 6p en mosaicismo, junto con el idiograma representando la alteración. C. Patrón del microarray de SNPs del cromosoma 16 mostrando la duplicación de unas 22 Mb en 16p, junto con el idiograma que representa la alteración descrita.
Tanto los aCGH como los microarrays de SNPs constituyen lo que se denomina cariotipado molecular, que permite diagnosticar reordenamientos en cualquier lugar del genoma, tanto trastornos genómicos recurrentes como no recurrentes. Ofrecen un mayor rendimiento diagnóstico (15-20%) comparado con el cariotipo(9), por lo que se han convertido en técnicas de elección iniciales para el estudio etiológico de cuadros de discapacidad intelectual, trastornos del espectro autista y/o anomalías congénitas no bien definidas clínicamente. El cariotipo debería reservarse como indicación primaria para el estudio de pacientes con cuadros cromosómicos reconocibles (como síndrome de Down), casos con historia familiar de reordenamientos cromosómicos y en el estudio de la infertilidad y/o abortos múltiples(9).
Existen además muchos estudios en el ámbito prenatal que comparan el rendimiento del cariotipo convencional respecto al cariotipado molecular por microarrays en muestras fetales. Los microarrays incrementan en un 5-10% la tasa de detección de alteraciones cromosómicas relevantes en embarazos de alto riesgo y un 1-2% en los embarazos de bajo riesgo(10). No obstante, también hay que mencionar que estas técnicas de más resolución pueden detectar más variantes de significado incierto, que son difíciles de interpretar y asesorar. El Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología conjuntamente con la Sociedad de Medicina Materno-Fetal han consensuado recomendaciones para el uso del cariotipado molecular en el ámbito prenatal. Está absolutamente indicado tras la detección ecográfica de más de una anomalía estructural mayor fetal y en los casos de muerte fetal intrauterina o mortinatos. Si se decide hacer una prueba prenatal invasiva en embarazos con feto estructuralmente normal, se debería dar la opción de realizar un cariotipo convencional o uno molecular por microarray. En cualquier caso, es imprescindible realizar siempre una sesión de asesoramiento genético previo a la prueba y obtener un consentimiento informado(11).
La secuenciación de alto rendimiento o de nueva generación (Next-generation sequencing,NGS) empezó en el año 2005 con un nuevo tipo de secuenciadores que, bajo un principio similar a los microarrays, generaban secuencias cortas (35-500 pb) que eran inmovilizadas en un soporte sólido para luego ser secuenciadas(12). Desde entonces, la tecnología de NGS ha ido creciendo en eficacia y reduciendo precios, en menos tiempo y con mayor validez analítica(7). Actualmente, existen diferentes plataformas disponibles (Roche 454, Ion Torrent/Proton, Illumina, SOLiD) que varían en el soporte, el método de secuenciación y la detección de las secuencias(12).
Las aplicaciones de la NGS en la práctica clínica con fines diagnósticos, incluyen: la secuenciación del genoma completo y la secuenciación de capturas selectivas de genes, regiones concretas o de todas las regiones codificantes o exoma(12). Estas capturas selectivas, que combinan tecnologías de selección por hibridación similar a los microarrays seguidas de la secuenciación de lo seleccionado, se han desarrollado para minimizar el coste final de la secuenciación del genoma, a la vez que se reduce la complejidad del análisis. La intensidad de la cobertura (“depth of coverage”) es el número de veces que una base del genoma ha sido secuenciada. Cuanto mayor cobertura, mayor es la fiabilidad del método sin falsos negativos ni positivos, y es posible incluso detectar variantes presentes en mosaicismo. No obstante, las variantes detectadas por NGS suelen todavía ser confirmadas posteriormente, mediante otros métodos como la secuenciación de Sanger, para darles validez diagnóstica y permitir el estudio de otros familiares del caso índice si procede.
La captura selectiva para NGS está indicada para enfermedades que pueden estar causadas por mutaciones en varios genes diferentes (heterogeneidad de locus), cuando ya se conocen bien cuáles son los genes involucrados(7). Si hay heterogeneidad, el estudio por secuenciación clásica gen a gen es muy costoso. Se han desarrollado paneles de captura y NGS para diversas enfermedades o grupos de enfermedades. Las ventajas de la captura selectiva y NGS son: su bajo coste por base secuenciada, alta precisión, relativa facilidad para la manipulación e interpretación de los resultados con corto tiempo de respuesta y menor riesgo de obtener hallazgos de significado incierto(7). Por el contrario, las limitaciones incluyen: la necesitad de rediseñar el experimento si se desea incluir nuevos genes y que no permiten investigar para identificar nuevos genes causales de la enfermedad(12).
El exoma se refiere a las regiones codificantes y reguladoras identificadas de todos y cada uno de los genes del genoma (funcionales como proteínas o RNAs), lo que supone aproximadamente el 1-1,5% del genoma completo (30-70 Mb)(13). La secuenciación del exoma supone una buena estrategia para buscar mutaciones causales de enfermedades mendelianas (Fig. 3).
Figura 3. Resultado de la alteración encontrada por secuenciación de exoma en un paciente diagnosticado de síndrome de Bardet-Biedl. A. Idiograma del cromosoma 7, con la localización del gen PTHB1/BBS9 (7p14.3) marcada en rojo. B. Secuencia del gen y de aminoácidos del exón donde ha ocurrido el cambio. C. Alineamiento de todas las lecturas de la secuencia realizadas en la región; en rojo está marcada la sustitución detectada en cada lectura y su localización respecto al gen (Modificado de Martos Moreno, Rodríguez-Santiago, González Gutiérrez-Solana, Pérez-Jurado, & Argente, 2013).
Además de la reducción de material genético a secuenciar respecto al genoma completo, se estima que el 85% de las mutaciones causantes de enfermedad se encuentran localizadas en estas regiones codificantes y funcionales del genoma(7). En relación a la técnica, los pasos son los mismos que en cualquier captura selectiva seguida de NGS. Se requiere un gran soporte bioinformático y conocimientos de genética para el análisis y detección de las variantes que son relevantes para la patología en estudio. Cada exoma contiene aproximadamente 10.000 variantes no-sinónimas (causa un cambio en el aminoácido) respecto al exoma de referencia, en número variable dependiendo de la etnia y los métodos de detección(13). Además de los filtros técnicos para evitar artefactos (falsos positivos), para filtrar la información importante derivada de NGS se deben considerar varios factores: la frecuencia, en cada variante en la población control disponible, el tipo de variante (si causa o no un cambio en la proteína), la compatibilidad con el modo de herencia de la enfermedad (variantes en uno o los dos alelos del gen, o en el cromosoma X), la función conocida o predicha del gen afectado (compatible o no con el fenotipo de enfermedad) y la predicción de patogenicidad de la variante concreta, para lo que se dispone de diversos algoritmos. Se estima que cada individuo puede tener entre 50 y 100 mutaciones en estado heterocigoto, un porcentaje de la cuales podría causar un trastorno Mendeliano si se presentara en homocigosis(13). La secuenciación de exoma está indicada para detectar mutaciones responsables de enfermedades con gran heterogeneidad genética y/o fenotípica. En el estudio de 250 individuos con diferentes fenotipos neurológicos aislados (retraso psicomotor, discapacidad intelectual, trastorno del espectro autista, convulsiones) o asociados a otros problemas, el análisis del exoma tuvo una tasa de rendimiento diagnóstico del 25% (en 62 casos se encontró la causa molecular)(13). En los distintos artículos publicados hasta la fecha, el rendimiento diagnóstico de la secuenciación del exoma para enfermedades monogénicas oscila entre 10-54% según un informe especial del Centro de Evaluación Tecnológica(7).
Una característica de estas técnicas es que permiten detectar alteraciones en cualquier gen del genoma, incluso las variantes que no estén relacionadas con la enfermedad por la que se indicó el estudio. Existe todavía bastante controversia, incluso entre los profesionales del área, en cómo se debería proceder con estos hallazgos incidentes, relativos a problemas sobre los que no se ha consultado. Además de informar de su posible detección, el consenso más general es que, al menos deben investigarse los datos por si se detectara alguna variante claramente patogénica y sobre la que se pueda recomendar una acción clara en beneficio de la salud del paciente. Un ejemplo serían las mutaciones con clara susceptibilidad a cáncer precoz y alta penetrancia, que indicarían la conveniencia de establecer un programa de seguimiento específico para su prevención o tratamiento precoz.
Por último, la secuenciación del genoma completo es la técnica que mayor cantidad de información nos puede aportar. Con ella se obtiene información, tanto de las regiones codificantes como de las regiones no-codificantes, y tiene gran efectividad para detectar variaciones estructurales del genoma incluyendo puntos de rotura de algunos reordenamientos equilibrados. Por ahora su uso como herramienta diagnóstica en el ámbito clínico, se han aplicado solo a casos específicos. No obstante, ya hay datos que demuestran una utilidad clara con mejoría del rendimiento frente a los sistemas de captura, siendo la tasa de detección de mutaciones patogénicas superior al 50% en un estudio de 50 pacientes con diversos cuadros clínicos analizados junto con muestras de los padres(14). Es de esperar que las indicaciones clínicas se implementen de manera progresiva y a corto plazo, siendo ya un recurso a considerar en aquellos casos en los que se han agotado otras herramientas sin llegar al diagnóstico o para identificar puntos de rotura cromosómicos en alteraciones balanceadas(13). Las ventajas de estudiar exoma o genoma son ausencia de sesgo previo al analizar los datos, posibilidad de reanálisis en el futuro, técnica automatizable y posibilidad de detectar mosaicismo(12). Algunas limitaciones dependen de la existencia de regiones que pueden no alcanzar una buena cobertura, debido a problemas técnicos o características de la secuencia. Otras limitaciones derivan de estudios de exoma y genoma completo, derivan de la gran cantidad de información generada, planteando mayor dificultad para analizar e interpretar los datos (además de dificultades para su almacenamiento informático), así como el mayor riesgo de encontrar hallazgos de significado incierto y variantes incidentes(12).
NGS en el diagnóstico prenatal no invasivo
Actualmente, existe disponible una prueba prenatal no invasiva para cribado de aneuploidías y algunos trastornos genómicos recurrentes, que se basa en la secuenciación de nueva generación.
La NGS también ha jugado un papel fundamental para el desarrollo de herramientas de estudio prenatal, sobre todo para el estudio no invasivo mediante el análisis de DNA fetal en sangre materna. Tras múltiples intentos para establecer pruebas fiables no invasivas para la detección de aneuploidías, como la trisomía 21 fetal y otras enfermedades genéticas, usando sangre materna como fuente de obtención de DNA o células fetales(8), la disponibilidad de NGS ha permitido alcanzar ese hito(15,16). En el plasma sanguíneo circula DNA libre (pequeñas moléculas protegidas por su unión a histonas en nucleosomas) derivado de células de diversos orígenes que han sufrido apoptosis. Aproximadamente, el 10% del DNA circulante en plasma de una mujer embarazada es de origen fetal(17). Mediante NGS de dicho DNA plasmático, se secuencian fragmentos especialmente enriquecidos para regiones de interés, y tras su alineamiento con el genoma de referencia y análisis informático se determina si existe un exceso o déficit de secuencias de un cromosoma entero o una porción del mismo(12).
Estas pruebas prenatales no invasivas son una alternativa al triple cribado bioquímico y ecográfico del primer o segundo trimestre para posibles aneuploidías fetales, con una sensibilidad o tasa de detección y especificidad muy buenas: 99,5% con 0,1% de falsos positivos para la trisomía 21, 97% y 0,1% para la trisomía 18, y 79% y 0,1% para la trisomía 13(18). Al ser todavía una prueba de cribado, un resultado positivo deberá confirmarse mediante una prueba invasiva. En este momento, la mayor limitación de este cribado es el coste económico de la prueba.
Esta tecnología permite también detectar microdeleciones(19). En un estudio en que se analizaron 8 síndromes de microdeleción (1p36, Cri-du-chat, DiGeorge, Wolf-Hirschhorn, Prader Willi, Angelman, Miller-Dieker y Phelan-McDermid), la tasa de detección fue de entre el 92,3% y el 97,2%(19). Desde entonces, en algunas pruebas optimizadas y distribuidas comercialmente para el diagnóstico prenatal no invasivo, se ha incluido el cribado de varios síndromes de microdeleción (22q11, 5p-, 1p36, 15q11) y dos aneuploidías (trisomía 16 y 22), además de las tres aneuploidías más comunes (trisomías 21, 18 y 13)(19).
Detección de portadores por NGS
El test de detección de portadores tiene como objetivo identificar aquellas parejas en las que ambos son portadores de la misma enfermedad para prevenir el riesgo de ocurrencia de una enfermedad recesiva.
A pesar de que las enfermedades mendelianas son infrecuentes en la población general, si las agrupamos son la causa de aproximadamente el 20% de la mortalidad infantil y de aproximadamente el 10% de hospitalizaciones pediátricas(20). Además de trabajos históricos mediante los que se ha conseguido reducir la incidencia de algunas enfermedades genéticas en poblaciones de riesgo, como las talasemias en la isla de Cerdeña, existen ya recomendaciones para el asesoramiento y cribado de poblaciones con mayor riesgo de padecer ciertas patologías. Por ejemplo, el Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología (ACOG) recomienda a individuos con ascendencia judía, realizar un cribado para las enfermedades de Tay-Sachs, Canavan, fibrosis quística y disautonomía familiar(21). En cuanto a la población general, las recomendaciones mínimas de la ACOG y el Colegio de Genética y Genómica Médica son ofrecer un cribado de fibrosis quística a todas las mujeres en edad reproductiva y de síndrome de Frágil X a todas las que tengan historia familiar sugerente(22). El objetivo de estos cribados es identificar parejas de riesgo (ambos portadores de enfermedad autosómico recesiva o mujeres portadoras de enfermedades recesivas ligadas al X), para poder prevenir la ocurrencia de la enfermedad. En un estudio poblacional mediante NGS de mutaciones en genes responsables de 448 enfermedades recesivas pediátricas con manifestaciones clínicas severas, se detectó que la media de mutaciones en heterocigosis por individuo era de 2,8(23). La especificidad de la técnica utilizada fue del 99,96% y la sensibilidad de aproximadamente el 95% para la detección de variantes.
Existen ya varios paneles generales y específicos de población con distribución comercial para la detección de posibles portadores de enfermedades recesivas severas y de inicio en edad infantil(23). Estos paneles de cribado se pueden ofrecer a parejas prospectivas previamente a la toma de decisiones reproductivas, y podrían estar claramente recomendados para parejas con alto riesgo de padecer enfermedades mendelianas recesivas, como las pertenecientes a poblaciones con alta tasa de consanguinidad. También pueden aplicarse a la detección de portadores en donantes de gametos, para poder así seleccionar el receptor compatible y minimizar el riesgo de tener un hijo afecto por estas enfermedades(23).
De la misma manera que con todas las pruebas moleculares mencionadas en sus aplicaciones diagnósticas, es muy importante el asesoramiento genético pre-test y post-test, en el caso de las pruebas de cribado de portadores preconcepcionales. Durante la sesión de asesoramiento pre-test, se deberá informar sobre las limitaciones del estudio, el riesgo residual de tener un hijo afecto y las implicaciones que podrían tener los resultados para otros familiares.
Conclusiones
Existe una gran variedad de técnicas de análisis genéticos disponibles para el estudio del genoma humano, incluyendo nuevas tecnologías con alta capacidad de análisis y alta sensibilidad para la detección de anomalías genéticas responsables de enfermedades. Estos avances tecnológicos están cambiando de manera progresiva las pautas recomendables de actuación para el correcto diagnóstico de las diversas enfermedades y el asesoramiento de las familias. A pesar de la utilidad de varias de las técnicas para cribado diagnóstico, incluso en casos sin buena definición clínica, todavía es y será muy importante la orientación diagnóstica de cada caso previa a la selección de la pruebas, así como conocer la prueba a solicitar, sus indicaciones, limitaciones y los posibles resultados, tanto esperados como los riesgos de hallazgos incidentales e inesperados. Antes de solicitar una prueba genética, es necesario que se ofrezca un adecuado asesoramiento genético por profesionales formados, durante el cual se discutirán las implicaciones de la prueba tanto para el probando como para sus familiares, los posibles resultados (positivo, negativo, incierto, incidentales) y el manejo que se seguirá en cada uno de los posibles escenarios, incluyendo el caso de encontrarnos con hallazgos incidentales o inciertos. Hay que resaltar también la importancia de ofrecer toda la información mencionada por escrito y obtener un consentimiento informado firmado por el paciente y/o familia.
Bibliografía
Los asteriscos reflejan el interés del artículo a juicio del autor.
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Artículo de revisión enfocado en las técnicas moleculares disponibles, los factores a tomar en cuenta al momento de seleccionar la técnica, así como posibles resultados, consideraciones éticas y el costo. La revisión incluye definiciones de los términos y estudio de casos.
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Es un artículo enfocado en la tecnología de secuenciación de última generación, incluye un breve resumen acerca de la tecnología, las diferentes plataformas disponibles, ventajas e inconvenientes con respecto a técnicas tradicionales y las aplicaciones en el diagnóstico genético pre- y postnatal.
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Artículo de revisión enfocado en la aplicación de la secuenciación del exoma en la genética médica y su utilidad en algunos trastornos, con ejemplos de enfermedades monogénicas con etiología desconocida, fenotipos con gran heterogeneidad genética, trastornos de movimiento y cáncer.
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Artículo de revisión sobre las pruebas de detección de portadores, que incluye una breve descripción de las técnicas, su relevancia en salud pública y los diferentes escenarios clínicos en los que podrían ser utilizadas.
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Revisión de consenso del Colegio Americano de Genética y Genómica Médica (ACMG), en relación a las pruebas prenatales no invasivas. Es un artículo enfocado a la práctica clínica que incluye una explicación acerca de las limitaciones técnicas y la información que debería ser comentada en las sesiones de asesoramiento pre- y post test.
Caso clínico |
Niño de 2 años y 7 meses, cuyos padres (etnia árabe) solicitan estudio por obesidad mantenida desde el nacimiento, ya con macrosomía neonatal (peso al nacimiento de 4.200g), a pesar de una ingesta alimentaria referida como adecuada. Antecedentes familiares Padres de etnia árabe y consanguinidad en segundo grado. No obesos. Antecedentes personales Al nacimiento se detectó polidactilia en las 4 extremidades. Leve retraso del desarrollo psicomotor, con mayor afectación en el área de lenguaje. Exploración física Índice de masa corporal +5,6 DE, talla en el percentil 90. Abundante panículo adiposo de distribución generalizada, de predominio abdominal. Polidactilia postaxial en las 4 extremidades, con sindactilia parcial entre el 5° y 6° dedos de los pies. Pene de tamaño 2 x 1 cm y escaso desarrollo de la bolsa escrotal, con testes presentes de 1 cc de volumen y consistencia normal. Nistagmus vertical bilateral. En el estudio oftalmológico, se objetivó distrofia retiniana bilateral (retinitis pigmentaria), miopía magna y catarata polar posterior en ojo derecho. Exploraciones complementarias Se realizaron las siguientes exploraciones con resultado normal: Hemograma, bioquímica sérica, hormonas tiroideas, insulina y perfil lipídico. Cariotipo: 46, XY.
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Propuesta de algoritmo diagnóstico actual, para decidir la prueba genética indicada ante cada tipo de enfermedad genética o sospecha clínica. Este algoritmo estará sujeto a cambios conforme a los avances tecnológicos y la instauración de nuevas metodologías en la práctica clínica.
SWB (síndrome de Williams-Beuren), NF1 (Neurofibromatosis tipo 1).